Jak kvantifikovat gely elektroforézy pomocí obrazů

Elektroforéza je základní technika používaná pro klonování genů a další pokročilé experimenty v molekulární biologii. Vědci obvykle používají elektroforézu s jediným účelem, aby oddělily jednotlivé molekulární složky DNA, RNA nebo bílkoviny v plochém gelu. Tento postup umožňuje vědcům určit počet molekul určitého typu přítomných ve vzorku a jak velké jsou tyto molekuly. K tomu je umožněno, aby se vzorek migroval podél gelu, během migrace se dělí na pásy různých velikostí v dobře definovaných bodech gelu. Nakonec je vyfotografován gel obsahující molekuly, které migrovaly. Toto je obraz, který musí být kvantifikován za účelem analýzy dat.

Kvantifikace gelových obrazů z elektroforézy

Vyberte vhodný software pro analýzu obrázků. To je povinné, a proto je třeba předem získat přístup k denzitometrickému softwaru, jako jsou Kodak DirectView EVP Plus a Carestream Molecular Imaging. Na druhou stranu existují také levnější (například Adobe Photoshop) a volně použitelné software navržené speciálně pro analýzu vědeckých obrazů (například ImageJ). ImageJ je bezplatný balíček, který má všechny funkce, je běžně používán v laboratořích molekulární biologie a je snadno ovladatelný. Pro účely tohoto článku použijeme ImageJ jako příklad. Principy každého kroku jsou však univerzální a snadno použitelné pro všechny typy softwaru pro analýzu obrazu.

Převedete obrázek do použitelného formátu. ImageJ je kompatibilní s mnoha zobrazovacími zařízeními a kamerami používanými v laboratořích, které provádějí elektroforézu. Je však běžnou praxí, jak vytvořit .JPEG, .TIFF nebo jiné univerzální formáty obrazu, které je třeba analyzovat.

Import obrázků do softwaru pro analýzu obrázků. Některé programy pro analýzu obrázků dávají importované obrázky nižší rozlišení, odlišný kontrast a jiné problémy s kvalitou obrazu, takže je vhodné importovat všechny formáty a vybrat ten, který má nejvyšší kvalitu v softwaru vybrané. ImageJ nemá žádné problémy s rozlišením a zachovává kvalitu surových dat.

Převést barvu obrazu na "šedou stupnici". V ImageJ vyberte kartu "obrázek" av nabídce klikněte na "stupně šedi".

Stanoví vhodné parametry měření pro analýzu. Na kartě Analýza vyberte možnost "Nastavit měření" a v rozbalovací nabídce vyberte oblasti "Prostor", "Průměrné šedé hodnoty" a "Integrovaná hustota".

Nastavte správnou stupnici pro analýzu. V příkladu softwaru klikněte na "Analyzovat", pak na "Nastavit měřítko" a v mezerníku pro délku jednotky napište "pixely".

Invertujte barvy, abyste získali vizuální čistotu. Na kartě Upravit vyberte možnost "Invertovat" tak, aby světlo vypadalo tmavě a naopak.

Vyberte požadované pásky v obraze. V paletě nástrojů vyberte nástroj Volný výběr a přetáhněte ukazatel myši podél okraje prvního pásu nebo pásma kontrolního experimentu. Vyberte pouze pásmo a vyhněte se všem stínům pozadí, což je v podstatě šum.

Měření (tj. Vyčíslení) vybrané oblasti. Stiskněte tlačítko "m" a ve výsledném okně se objeví měření integrované hustoty, plochy, průměrné hodnoty šedé atd. Opakujte předchozí kroky, dokud nezměříte všechny pásma. Potom zkopírujte všechny hodnoty do tabulky. Kvantované snímky jsou nyní připraveny k analýze dat v tabulkovém programu.